1从引物自身 着手,重新设计引物,这是最根本解决这一问题的办法;
2.可能模板有问题;模板浓度过小,适当加大模板量;
3.Taq酶,引物,Mg2+浓度可能过高,可 降低它们的浓度;
4.取你所要加的上下游引物混合后,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟,然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却,这时再加入反应体系当中,引 物二聚体就会消失的;理由:引物可能会发生发夹结构,自身环化等结构,在100摄氏度下的沸水中煮5分钟可使引物变为单链,以减少二聚体。不过有人认为在 PCR仪上95度变性5min也同样达到目的,而且成功试过通过延长退火时间也可以消除引物二聚体。
5.所配MIX中加5%的甘油或者5%的DMSO,可 以增强特异性;
6.PCR反应体系的配制在冰上进行,最后加TAq酶,PCR结束后,产物勿放置在室温下过长时间,有人认为室温下有些TAQ酶会将多余的 引物合成为二聚体。
7.增加循环数;
8.降低退火温度后有条带,则应逐渐提高温度,若提高温度的同时产物量减少,则考虑增加镁离子浓度(根据扩增片断长度 而定,片段长则相应镁离子浓度应该高一些);
9.若降低退火温度,发现还是只有引物二聚体,而且镁离子的浓度在20-25mmol/l没有区别,则考虑 Buffer等试剂没有完全融解、混匀,导致吸取的试剂浓度不对。
10.以上次的pcr产物作模板二次pcr,可以提高引物与模板的特异性,减少引物二聚 体,如果两次时间间隔短的话,可以把原产物稀释100-1000倍,如果间隔较长可以稀释50-100倍;
首先在设计引物的时候,要注意避免产生引物二聚体.现在的引物设计软件都会有一个dimer的选项,可以看出你设计的引物是否会发生二聚体.如果会形成二聚体,并且序列不能有大的变动,那就注意一下在3'端别发生dimer的互补.
其次,在PCR时提高退火温度可以提高PCR的特异性,可以减少引物二聚体.
改变Primer和DNA template的比例
加DMSO或者使用hot-start也能解决
可能需要重新设计引物
一对引物之间,或者引物自身有连续3个以上的可以互补结合的碱基对,就容易发生聚合,形成二聚体。
首先在设计引物的时候,要注意避免产生引物二聚体.现在的引物设计都会有一个dimer的选项,可以看出你设计的引物是否会发生二聚体.如果会形成二聚体,并且序列不能有大的变动,那就注意一下在3'端别发生dimer的互补. 其次,在PCR时提高退火温度可。
从电泳图片看,不仅是引物二聚体的问题,是产物的特异性不好。可以试着跑下引物,看是否有条带或被降解,再有就是设置pcr的条件,试着提高退火温度。最主要的就是2个东西:引物的结合效率和模板的质量。
我个人觉得你应该先从引物考虑虽然PCR过程中受很多因素的影响但是引物和退火温度无疑是很重要的两个方面没出现引物二聚体只能说你设计的两端的引物没有错配啊等等你可以找有经验的师兄师姐帮你设计引物看看顺便啊学习一下引物设计的经验引物到了之后,你可以先跑个沉降PCR看看比较适合退火温度我也听师兄说过可以跑个TOUCHDOWN另外你可以把Mg离子以及DNTP还有各个溶剂的量调高一些看能不能有东西用我师姐的话说如果这都跑不出那就没希望了。。但是一般是可以跑出来的~